Výběr radikálu pro kinetické stanovení antiradikálové aktivity
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2004 |
| Druh | Článek ve sborníku |
| Konference | MediFórum, Sborník abstakt |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Obor | Biochemie |
| Klíčová slova | ABTS; DMPD; DPPH; antiradical activity; polyphenolic compouns; polyphenols |
| Popis | Porušení rovnováhy mezi tvorbou a zánikem volných radikálů vede v organismu k oxidačnímu stresu, který se podílí na vzniku řady závažných onemocněních včetně kardiovaskulárních a nádorových onemocnění. Při ochraně organizmu před nadměrnou tvorbou volných radikálů hrají významnou roli nízkomolekulární antioxidanty a to především v extracelulárním prostředí, kde je aktivita antioxidačních enzymů nízká. K posouzení antiradikálové aktivity antioxidantů nebo jejich směsí v biologických vzorcích se často používají metody založené na zhášení stabilních barevných organických radikálů. Antiradikálový účinek se doposud převážně vyjadřuje jako celková antioxidační kapacita nebo v hodnotách EC50. Oba tyto způsoby hodnocení však mají vážné nedostatky, protože neodráží s jakou rychlostí zháší antioxidant radikály. Cílem práce bylo vypracování kinetické metody stanovení antiradikálové aktivity na základě určení rychlostních konstant reakce antioxidantů s radikály a posouzení výhod použití jednotlivých radikálů. Stanovení antiradikálové aktivity se provádělo na spektrofotometru Shimadzu UV-1601. K měření jsme použili tyto radikály: 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) a radikály generované oxidací 2,2-azino-bis(3-ethybenzthiazoline-6-sulfonové kyseliny) (ABTS) a N,N-dimethyl-para-fenylendiaminu (DMPD). Měření s radikálem DPPH probíhalo v methanolu, měření s radikály ABTS a DMPD v 5 mM fosfátovém pufru pH 7,4. Abychom mohli určit rychlostní konstanty reakce a řád reakce, počáteční podmínky jsme volili tak, že koncentrace jednoho ze substrátů (bud radikálu nebo antioxidantu) byla mnohem vyšší než koncentrace druhého substrátu. V každé sérii pokusů jsme počáteční koncentraci jednoho substrátu zvolili konstantní, zatímco koncentrace druhého substrátu byla proměnná. Kinetické měření antiradikálové aktivity jsme začali s radikálem DPPH v methanolu. Zjistili jsme, že stanovení při nadbytku DPPH umožňovalo, narozdíl od stanovení při nadbytku antioxidantu, určení rychlostní konstanty reakce. Místo očekávaného druhého řádu se reakce vždy překvapivě řídila kinetikou prvního řádu. Rychlost zhášení radikálu DPPH tedy závisela jen na koncentraci jednoho za substrátů, u většiny antioxidantů pouze na koncentraci antioxidantu, pro menší část antioxidantů (převážně estery kyseliny kávové a cystein) pouze na koncentraci DPPH. Celkem jsme stanovili rychlostní konstanty 25 antioxidantů, převážně fenolických kyselin. Nejrychleji reagovala s DPPH kyselina askorbová, která zhášela radikál DPPH přibližně milionkrát rychleji než nejpomaleji reagující kyselina parahydroxybenzoová. Nevýhodou použití DPPH ke stanovení antiradikálové aktivity je jeho nerozpustnost ve vodě. Proto jsme se dále zaměřili na radikály rozpustné ve vodě. Zhášení radikálu ABTS a DMPD za nadbytku koncentrace radikálu nad antioxidantem se rovněž řídilo kinetikou 1. řádu. Zjistili jsme, že zhášení radikálu ABTS ve fosfátovém pufru 7,4 probíhalo přibližně 5000krát rychleji než zhášení radikálu DPPH v methanolu. Kvůli příliš rychlé reakci ABTS jsme byli schopni určit rychlostní konstanty jen u 11 nejpomaleji reagujících antioxidantů. Nejvhodnějším radikálem ke stanovení antiradikálové aktivity byl dosud málo užívaný radikál DMPD. Rychlost reakce DMPD s antioxidanty umožňovala výpočet rychlostních konstant i ve vodném prostředí. Určitou nevýhodou je pouze nutnost generovat tento radikál v roztoku. |
| Související projekty: |