Využití elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy v proteomice pro on-line tryptické štěpení proteinů

Logo poskytovatele
Logo poskytovatele

Varování

Publikace nespadá pod Filozofickou fakultu, ale pod Přírodovědeckou fakultu. Oficiální stránka publikace je na webu muni.cz.
Autoři

ZEISBERGEROVÁ Marta KLIMÍČKOVÁ Andrea GLATZ Zdeněk

Rok publikování 2008
Druh Článek ve sborníku
Konference XXI. biochemický sjezd ČSBMB a SSBMB
Fakulta / Pracoviště MU

Přírodovědecká fakulta

Citace
Obor Biochemie
Klíčová slova kapilární elektroforéza; EMMA; proteomika
Popis Proteomika je rychle se rozvíjející oblast biochemického výzkumu, jejíž hlavní náplní je charakterizace komplexních směsi proteinů extrahovaných z buněk či tkání. Dominantní metodou je zde dvojrozměrná elektroforéza 2D-PAGE. Přestože je schopna rozseparovat tisíce proteinů během jediné analýzy, má vážná omezení, jde o metodu pracnou a časově náročnou, nelze opomenout i limitovanou citlivost a dynamický rozsah. Proto jsou hledány jiné metody vyznačující se vysokou separační účinnosti, a především možností přímé kombinace s tryptickým štěpením a detekcí pomocí MS. Jako jedna z variant se také nabízí kapilární elektroforéza (CE), především pak její modifikace elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza (EMMA). Ta se vyznačuje plnou automatizací kombinovanou s velmi malou spotřebou vzorku, což je dáno tím, že EMMA využívá kapiláru nejenom jako separační medium, ale také jako reakční prostor. Cílem této práce bylo využít metodu EMMA pro on-line tryptické štěpení proteinů pro proteomický výzkum s předpokládaným spojením s detekcí pomocí MS. Vzhledem ke skutečnosti že pH optimum trypsinové reakce se liší od optimálního pH používaného v CE pro separaci peptidů, byla zde použita kombinace metody EMMA s technikou částečného plnění kapiláry. V tomto uspořádání je ta část kapiláry kde probíhá tryptické štěpení naplněna pufrem optimálním pro tuto reakci (Tris-HCl pufr pH 8.5), kdežto zbytek kapiláry základním elektrolytem optimálním pro separaci peptidů (0.1 M fosfátový pufr pH 2.5). Jelikož se proteiny liší svými pI a tím i efektivní mobilitou, bylo použito sendvičové dávkování, při kterém je vzorek proteinu nadávkován mezi dvě zóny trypsinu, což zaručuje jejich promíchání a tím i digesci. Analýza jednoho proteinu včetně digesce a separace vzniklých peptidů tak trvá jednu hodinu, což je značné zkrácení oproti klasické digesci v roztoku.
Související projekty:

Používáte starou verzi internetového prohlížeče. Doporučujeme aktualizovat Váš prohlížeč na nejnovější verzi.