Využití elektroforeticky zprostředkované mikroanalýzy v proteomice pro on-line tryptické štěpení proteinů
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2008 |
| Druh | Článek ve sborníku |
| Konference | XXI. biochemický sjezd ČSBMB a SSBMB |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Obor | Biochemie |
| Klíčová slova | kapilární elektroforéza; EMMA; proteomika |
| Popis | Proteomika je rychle se rozvíjející oblast biochemického výzkumu, jejíž hlavní náplní je charakterizace komplexních směsi proteinů extrahovaných z buněk či tkání. Dominantní metodou je zde dvojrozměrná elektroforéza 2D-PAGE. Přestože je schopna rozseparovat tisíce proteinů během jediné analýzy, má vážná omezení, jde o metodu pracnou a časově náročnou, nelze opomenout i limitovanou citlivost a dynamický rozsah. Proto jsou hledány jiné metody vyznačující se vysokou separační účinnosti, a především možností přímé kombinace s tryptickým štěpením a detekcí pomocí MS. Jako jedna z variant se také nabízí kapilární elektroforéza (CE), především pak její modifikace elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza (EMMA). Ta se vyznačuje plnou automatizací kombinovanou s velmi malou spotřebou vzorku, což je dáno tím, že EMMA využívá kapiláru nejenom jako separační medium, ale také jako reakční prostor. Cílem této práce bylo využít metodu EMMA pro on-line tryptické štěpení proteinů pro proteomický výzkum s předpokládaným spojením s detekcí pomocí MS. Vzhledem ke skutečnosti že pH optimum trypsinové reakce se liší od optimálního pH používaného v CE pro separaci peptidů, byla zde použita kombinace metody EMMA s technikou částečného plnění kapiláry. V tomto uspořádání je ta část kapiláry kde probíhá tryptické štěpení naplněna pufrem optimálním pro tuto reakci (Tris-HCl pufr pH 8.5), kdežto zbytek kapiláry základním elektrolytem optimálním pro separaci peptidů (0.1 M fosfátový pufr pH 2.5). Jelikož se proteiny liší svými pI a tím i efektivní mobilitou, bylo použito sendvičové dávkování, při kterém je vzorek proteinu nadávkován mezi dvě zóny trypsinu, což zaručuje jejich promíchání a tím i digesci. Analýza jednoho proteinu včetně digesce a separace vzniklých peptidů tak trvá jednu hodinu, což je značné zkrácení oproti klasické digesci v roztoku. |
| Související projekty: |
|