| Popis |
Úvod: Zavádění nových modelů do výzkumu chorob s sebou kromě výhod obvykle nese řadu limitací a problémů. To se týká i atraktivního modelu pacient-specifických kardiomyocytů diferencovaných z lidských pluripotentních kmenových buněk (hiPSC-CM). Použitím vhodných metod měření je možné zaznamenat elektrickou aktivitu hiPSC-CM, která je tvarově podobná EKG. Hodnocení takového záznamu pak umožnuje získat hodnoty délky cyklu (CL) a trvání potenciálu pole (FPD), které jsou analogií intervalů RR a QT na EKG záznamu. Při vyhodnocování experimentálních záznamů jsme se setkali s problémem správného stanovení vrcholu pomalé repolarizační složky, který určuje konec intervalu FPD. Cílem této práce je diskutovat správnost určení FPD u hiPSC-CM. Metodika: K zaznamenávání elektrické aktivity hiPSC-CM byla využita technika multielectrode arrays (MEA2100-Lite-System) s vzorkovací frekvencí 10 kHz a použitím filtrů horní a dolní propust 1 Hz, resp. 3,5 kHz. Měření bylo prováděno na buněčném modelu hiPSC-CM (zdravé hiPSC-CM, tj. WT-RYR2, a pacient-specifické hiPSC nesoucí variantu Y4734C v RYR2, tj. Y4734CRYR2) po dobu 5 min v kontrolním Tyrodově roztoku při teplotě 37 °C. Poslední minuta záznamu elektrické aktivity byla vyhodnocena v programu pCLAMP 9.2 (Molecular Devices) a následně byla provedena analýza FPD. Výsledky a diskuze: Analýza FPD u hiPSC-CM s sebou nese určité komplikace. Záznamy elektrické aktivity se u těchto buněk v jednotlivých měřeních tvarově významně odlišují. FPD definujeme jako dobu trvání mezi první pozitivní/negativní výchylkou potenciálového pole, která je rychlá, s vysokou amplitudou a odpovídá depolarizační složce a vrcholem druhé pozitivní/negativní výchylky potenciálového pole, která je pomalá, s nízkou amplitudou a odpovídá repolarizační složce elektrické aktivity preparátu. Ve získaných experimentálních záznamech elektrické aktivity hiPSC-CM se objevuje problém s detekcí vrcholu pomalé repolarizační složky FPD, protože v záznamu pozorujeme více výchylek potenciálového pole v repolarizační oblasti signálu. Pro zlepšení detekcí byl použit Besselův filtr (mezní kmitočet 50 Hz). Stále zde však zůstává nejasnost v určení vrcholového bodu pomalé repolarizační složky určující konec FPD. Získané průměrné hodnoty FPD se mezi testovanými buněčnými modely WT-RYR2 (n = 9) a Y4734C-RYR2 (n = 8) hiPSC-CM signifikantně nelišily, avšak byla patrná tendence ke nižším hodnotám FPD u Y4734C-RYR2 hiPSC-CM s mediánem 0,226 s (Q1 0,197 s; Q3 0,306 s) vs. 0,348 s (Q1 0,116 s; Q3 0,629 s) u WT-RYR2. Závěr: Správnost stanovení FPD je významně závislá na tvaru zaznamenané křivky elektrické aktivity, který může být ovlivněn řadou parametrů charakterizujících použitý vzorek, např. úrovní diferenciace použitých hiPSC-CM, jejich kvalitou, homogenitou, podílem zastoupení různých podtypů hiPSC-CM (komorové vs. síňové), charakterem vzorku (2D vs. 3D) atd. Rovněž je klíčová vhodná úprava surového záznamu, např. pomocí filtrů. Zjištěné průměrné hodnoty FPD se pohybují v obvyklém rozmezí pro hiPSC-CM.
|