Analýza proteomu bakterie Paracoccus denitrificans
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2003 |
| Druh | Článek ve sborníku |
| Konference | VII. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů. Sborník příspěvků |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Obor | Biochemie |
| Klíčová slova | Proteome; Paracoccus denitrificans; Membrane proteins; Two-dimensional electrophoresis; Mass spectrometry |
| Popis | Gramnegativní bakterie Paracoccus denitrificans se vyznačuje značnou adaptovatelností na růstové podmínky: je schopna existence za podmínek aerobních či anaerobních, přičemž jako terminální akceptory může sloužit mnoho substrátů: kromě kyslíku také NO3-, NO2- či plynný N2O. Změna v expresi proteinů při přechodu z aerobních podmínek na anaerobní zřejmě souvisí s regulačními proteiny citlivými k azidu. Pro sledování všech těchto změn expresního profilu se jeví jako velice perspektivní soubor proteomických metod. Pro komplexní analýzu proteinového složení P. denitrificans byla nově zavedena metodika vysokorozlišovací dvourozměrné elektroforézy (2-DE) s imobilizovanými pH gradienty v prvním rozměru, a to jak v analytickém, tak i mikropreparativním uspořádání. Pro analýzu celobuněčného proteomu jsme vyvinuli postup přípravy vzorků a optimalizovali protokol pro jejich analýzu dvourozměrnou elektroforézou. Tento protokol může být použit např. pro srovnání změn expresního profilu vyvolaných různými terminálními akceptory. Pro metodicky velmi komplikovanou 2-DE analýzu membránových proteinů, které jsou však často funkčně důležitější, jsme srovnávali různé solubilizační postupy, přičemž byly využity v současné době nejúčinnější typy zwitteriontových detergentů. Kromě nejvhodnějšího složení vzorkového pufru zahrnuje optimalizovaný protokol také speciální pufrový systém pro SDS-PAGE. 2-DE gely získané tímto postupem byly dále srovnány s gely získanými z téhož vzorku pomocí dříve používané varianty 2-DE s nosnými amfolyty. Vypracovaným protokolem jsme sledovali vliv anaerobiosy na změny proteinového složení membrány bakterie P.denitrificans, přičemž některé z význačných proteinů na proteinové mapě již byly analyzovány MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií a úspěšně identifikovány. |
| Související projekty: |