Purifikace a krystalizace přijímačové domény receptorové histidinkinázy CKI1
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2007 |
| Druh | Článek ve sborníku |
| Konference | Bulletin České společnosti experimentální biologie rostlin a Fyziologické sekce Slovenské botanické společnosti |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| www | http://rustreg.upol.cz/fyzdny2007 |
| Obor | Genetika a molekulární biologie |
| Klíčová slova | cytokinins; histidine kinase; CKI1; receiver domain; purification |
| Popis | Cytokininy patří spolu s auxiny ke klíčovým regulátorům růstu rostlin. Potenciálním regulátorem přenosu cytokininového signálu u Arabidopsis thaliana byla identifikována receptorová histidinkináza CKI1. Tato histidinkináza se skládá z extracelulárně lokalizované, na membráně vázané receptorové domény, z intracelulární histidinkinázové domény a přijímačové domény (RD). Vzhledem k velikosti a různosti domén CKI1 je nutné pro určení struktury tohoto proteinu připravit jednotlivé domény samostatně. RD CKI1 byla klonována do expresního vektoru a exprimována v E. coli. Protein byl purifikován ve dvou krocích (Hi Trap Chelating HP se Zn2+ a Hi Load 16/60 Superdex 75) pomocí FPLC systému. Výtěžnost byla ovlivněna složením pufrů, kdy za použití Tris/HCl pufru bylo získáno ~27 mg proteinu/1L bakteriální kultury a při použití fosfátového pufru klesl výtěžek purifikace na ~19 mg/1L bakteriální kultury. Získaný protein byl homogenní za nativních i denaturačních podmínek na PAGE a jeho čistota byla >95%. Stabilita proteinu byla zvýšena za přítomnosti EDTA. Protein byl použit na krystalizační pokusy a byly získány první krystaly proteinu. V současné době jsou podmínky krystalizace optimalizovány. |
| Související projekty: |