Cílem tohoto projektu je zdokonalit a rozšířit aplikační množnosti kapilární elektroforézy, speciálně její modifikace metody EMMA (Electrophoretically Mediated MicroAnalysis) pro stanovení aktivity a studium membránově vázaných enzymů. Konkrétně bude studie zaměřena na skupinu důležitých detoxikačních enzymů – cytochromy P450, které se v organismu podílí mimo jiné na metabolismu léčiv, jejich detoxikaci, případně aktivaci. Hlavní pozornost bude zaměřena na možnost kombinace metody EMMA s technikou částečného plnění kapiláry, při které je část kapiláry naplněna pufrem optimálním pro příslušnou enzymovou reakci, zatímco zbytek kapiláry základním elektrolytem optimálním pro separaci substrátů a především produktů příslušné enzymové reakce. Tím by měla být odstraněna hlavní limitace metody EMMA, kterou je právě potřeba stejného pufru – základního elektrolytu jak pro enzymovou reakci, tak pro vlastní separaci. Uvedená metoda bude využita pro stanovení aktivity a studium různých izoenzymů cytochromů P450 a to za použití různých módů kapilární elektroforézy – kapilární elektroforézy ve volné kapiláře, micelární elektrokinetické kapilární chromatografie, případně chirální kapilární elektroforézy. Bude přitom použita klasická UV-VIS detekce s diodovým polem, pro identifikaci analytů bude testována MS v off-line uspořádání. Jako zdroj cytochromů P450 bude využita mikrosomální frakce, v případě dostupnosti rekombinantní formy cytochromů P450. Jako substráty bude testována celá řada důležitých farmakologických substancí. Hlavní výhodou této metody je malá spotřeba chemikálií, což je důležité především v případě enzymových preparátů, substrátů, případně inhibitorů. Automatizace všech kroků vlastního stanovení navíc eliminuje možné experimentální chyby.

Publikace